《自然》支招微生物培养：技术发展迅猛，未来要搞定一切！

这是《肠道产业》第 307 篇文章

编者按：

宏基因组测序技术的出现让我们能够了解不同环境中微生物组的组成，然而仅仅依靠宏基因组测序技术无法解决所有问题，比如，这些微生物究竟吃什么？会产生什么代谢物？如何与其它微生物互作？

要回答这些问题，我们必须在实验室条件下分离并培养出这些微生物。遗憾的是有大量通过测序被鉴定出的微生物我们至今仍然无法成功培养。那么，有哪些要素是在培养新的微生物时要注意的呢？有什么新的技术方法可以帮助我们培养微生物吗？

今天，我们特别编译了最近发表在 Nature 杂志上的关于如何分离并培养微生物的文章，希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。

无法培养的微生物

每一位进入 Yoichi Kamagata 的实验室，期望培养出有趣微生物的研究者都要经历这样一个开始：他们会被要求先尝试培养 Oscillospira guilliermondii，这是一种在牛羊胃中发现但从未在实验室条件下被成功培养的微生物。

Kamagata 是位于日本筑波的产业技术综合研究所 （AIST）的微生物学家，十几年来，他一直痴迷于这种杆状微生物。这种微生物的大小是著名的肠道侵入者——大肠杆菌大小的十倍甚至十倍以上，而且它们看起来似乎只在食草动物体中茁壮生长。

Kamagata 团队中的工程师和微生物学家 Masaru Nobu 惋惜道：“目前为止，没有人成功。” 

Oscillospira guilliermondii 并不是唯一一种没有被培养出来的微生物，实际上绝大多数微生物都未被培养出来。微生物“暗物质”，也就是这些未知的微生物可能具有有用的酶、新的抗菌素和其它的新物质。

虽然现代宏基因组学技术能够一次性对群落中所有微生物的 DNA 进行测序，从而展示不同环境下的微生物组成，但是这种技术依然无法帮助研究人员解答关于微生物的基本问题，比如，它们吃什么？它们会产生哪些代谢物？它们在环境中如何与其他微生物相互作用？想要找到这些问题的答案，微生物学家们必须在实验室中先分离再培养这些生物。

这可能是个棘手的事。一些微生物长得非常慢，对培养环境有着苛刻的需求，或者可能只在某些特定微生物存在的情况下生长。

一些科学家采取了无靶向的方法，对这些微生物采取的策略是任何在其中生长的微生物都可能是有趣的；另一些人则瞄准了那些他们想要了解更多的特定的微生物。无论采用哪种方法，要培养一些其他人之前没有培养出的微生物，都需要毅力、耐心和运气。

“相信自己可以在不培养出微生物的情况下来研究它们，是错误的观念。”法国马赛地中海大学医院感染研究所主任 Didier Raoult 说。

1983 年，Raoult 就开始了他的探索，当时他还是个“年轻人”。他决定要研究一类名为立克次体（Rickettsia）的微生物，尽管这种微生物早已因难以分离和培养而声名远扬，但是他还是想要研究它。他的学生也拥有同样的精神，一些人甚至在实验室里排便，以便能够快速地把样品放入无氧条件中，来促进这些有趣的微生物生长。

虽然他们仍没有培养出他们想要的立克次体，但是他们的奉献至少揭示了一个新菌种——Faecalibacterium timonensis，并且使得培养其它的微生物成为可能——为在实验室条件下培养一系列对氧气敏感的微生物打开了大门。

图.用于原位培养的 ichip 装置

模拟条件和原位培养

Raoult 还使用来自患者或是其他志愿者的样本进行了更为广泛、常规的搜索。他使用的方法被称为培养组学（culturomics ）¹，该方法结合了能够提供不同培养条件的自动化液体处理技术，并会通过质谱和 rRNA 测序来确定生长的微生物。

Raoult 预估目前为止已经能在实验室条件下培养出 700 多种微生物，这些微生物主要是来自人体肠道。

Raoult 说，事实上，他实验室最大的挑战之一，是为这些新菌种命名并作出描述。这个团队常常选择用于致敬其他研究者、反映粪便样本供体的疾病或是强调研究所地点的名字。

比如，最近的一些研究涉及一个以城市马赛 Massilia（Marseilles 的古名²）命名的杆状细菌——Gordonibacter massiliensis；又比如另一个名为 Prevotella marseillensis 的细菌，它来自一个住在马赛且患有艰难梭菌（Clostridium difficile）感染的供体³。

像 Raoult 这样的研究者一直尝试在实验室中找到适合新的微生物生长的条件，因此，他们常常会模拟自然环境。但是 Slava Epstein，马萨诸塞州波士顿东北大学的微生物学家，则更进了一步。他说：“我们为什么要模拟呢？我们直接在自然中培养这些生物。”

Epstein 的团队设计了多种设备，使得研究者们能够在天然土壤或沉积物中培养纯净的微生物。

一个相对便宜的设备是分离芯片（isolation chip），也叫 ichip，是由一个微量移液器的尖头制成的⁴。研究人员在每个小孔中加入用融化的琼脂稀释的微生物样本，以保证每个孔中能只含有一种或几种原始微生物。而架子两侧的半渗透树脂膜使得营养素和其他物质能够从周围环境进入到小孔内，但是不允许其他微生物的进入。

通常情况，这个团队会收集一桶土壤，然后按照上述方法使用 ichip，接着他们就可以培育他们的微生物了。当然，他们偶尔也会把 ichip 放置在自然环境中，但是这可能会受到来自狗和其它野生生物的干扰。

Epstein 说：“我们最讨厌的就是螃蟹，因为它们有时候会用钳子戳破装置的膜。”

2016 年，Epstein 团队的 Brittany Berdy 在格陵兰岛西北海岸搭上了一架飞往图勒空军基地的军机，去找寻能够适应极端环境的微生物。她去了基地附近一个未命名的湖泊，并在寒冷的湖水中放置了 ichip，然后在几周后返程取回了它们。

“当时我们已经在北方了，但是你得接着再往北才能看到北极光。”Berdy 回忆道，她现在在马萨诸塞州剑桥市的布罗德学院。

回到波士顿后，Berdy 试图使用不同浓度的不同物质来模拟湖中的条件。最棘手的部分是，模拟湖水 10℃ 的温度——对于水浴来说太冷了，对于冷藏室来说过暖了。不过，该团队最后成功了，他们使用了一个冰箱，并把温度调到最高，然后半开着冰箱门。

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图片来源：Fabio Buonocore

重要的伙伴

诸如 Berdy、Epstein 和 Raoult 这样的研究者并不确定他们能从他们的培养物中获得什么，但是另一些研究者常常在寻找一些特定的东西。

比如，田纳西州的橡树岭国家实验室的微生物学家 Mircea Podar 对不同的Saccharibacteria（过去被称为 TM7）非常感兴趣，这是人体微生物组中的一部分，直到最近才在实验室中培养出来。

1996 年，通过对泥沼样本的测序，而不是通过培养，鉴定出了 Saccharibacteria ⁵。尽管在口腔微生物组中这一类微生物并非特别丰富，但是它们的数量会随着特定疾病（包括牙周病）而变化，这表明这类细菌对健康有一定的影响。

人的肠道中，猫、狗和海豚的口腔中，以及土壤、沉积物和污水中都发现了这类细菌。“它们几乎哪都有。”Podar 说。

20 世纪 10 年代初期，Podar 设计了一个分离 Saccharibacteria 的方案：利用微生物的基因组，也就是通过单细胞测序来预测哪些蛋白质会出现在细胞表面，而后制造针对这些蛋白的抗体。接着，研究者们就可以利用被荧光素标记的抗体来标记微生物，然后可以再利用流式细胞仪把目标微生物从唾液样本中分离出来。

虽然参与这个项目的首位博士后 James Campbell，利用这种方法获取了一些含有 Saccharibacteria 的培养物，但是直到几年前，也就是 2014 年 Karissa Cross 接手这个项目后，这个团队才算是真正迎来了成功。

“这太难了，有太多次我们觉得这几乎不可能发生。”Cross 回忆道，现在她是田纳西州纳什维尔的范德比尔特大学的一位博士后。她尝试了液体培养基、固体培养基和巧克力琼脂（用溶解的血红细胞制成）等方法。“制备培养基就需要很多天。”然而结果常常无一奏效。

2015 年，其他研究者报道了一个重要的线索：Saccharibacteria 无法独立存活⁶。这些微小的球状细菌，直径只有 200~300 纳米，需要来自放线菌门的宿主。这意味着在试图分离 Saccharibacteria 的过程中，Podar 的团队无意间忽略了一个关键的搭档。

最终，在 2018 年夏天，Cross 从她的一个联合培养物（不止含有 Saccharibacteria，也可能含有一个新的菌科）中获得了与 Saccharibacteria 匹配的 DNA 测序结果⁷。这是她研究生生涯中最重要的发现时刻，她说。

她给 Podar 发邮件：“我觉得我们发现它了。”几秒后，她就听到走廊里 Podar 的脚步声。然后，他们击掌庆祝。

正确的配方

Jörg Overmann 说，在喂养挑剔的微生物时细节很重要。有时候，标准培养基中提供的氨基酸和糖类的“自助餐”也许并不是正确的方法，相反，降低营养素的浓度可以阻碍快速生长的微生物的生长，从而给长得慢的那些微生物留下生长的时间。

Overmann 是一位微生物学家，担任布伦施威格州莱布尼茨研究所（DSMZ-German）的科学主任。

物理生长基质也很重要。Overmann 的团队有时会在液体培养基中悬挂一块固体——如不锈钢或玻璃——为生物膜形成提供基质。“我们得到了完全不同于琼脂板上得到的东西。”他说。在一个使用这种技术处理的新鲜水样和土壤样本的研究中，研究小组捕获了十多种以前从未培养过的细菌，其中包括至少五种新细菌⁸。

Kamagata 的团队则利用生物反应器来维持营养素的供应并移除废弃物。他说，把整体营养素维持在一个低水平可以更好地反映目标生物的适宜生长条件。

研究人员和他们的同事们第一次在反应器内悬挂了一个聚氨酯海绵（像厨房的海绵）来培养一种由名为 Asgard archaea 进化而来的深海古细菌。

要想知道从哪里开始，研究人员可以查阅 BacDive 的数据库，其中罗列了来自 34 个细菌门和 3 个古细菌门的超过 80,000 株培养菌株的特性和培养条件。

关于遗传学信息，德国弗里德里希·席勒大学耶拿分校微生物学家 Christian Jogler 说：“如果有的话，也能够提供线索。”

但是 Jogler 警告说，即便是最普通的操作也会造成影响。

Jogler 的团队没有依赖于如 Milli-Q 这样很多实验室都在使用的超纯水系统，而是通过二次蒸馏法来制造纯净水。他说，Milli-Q 可能会含有阻碍某些培养物生长的化学物质。此外，他还补充说，通常作为胶凝剂的琼脂也可能会抑制生长，所以有时他们的团队会用结冷胶等替代。

Kamagata 的团队发现，甚至连制备琼脂的方式可能都很重要。当琼脂与磷酸盐一同经过高温杀菌时，会产生过氧化氢从而阻碍某些微生物生长。单独对这些组分进行高温杀菌可以解决这个问题，这也让这个团队培养出先前未培养出的微生物¹⁰。

当然，最为关键的还是耐心。在耗时超过 12 年后，Kamagata 和他的同事们终于培养出一种古细菌，暂名为 Prometheoarchaeum syntrophicum。不过，只要微生物学家一旦成功培养出某种微生物，之后这个微生物就能够快速生长。

Epstein 把这个过程称为“驯化”。他认为，在最初的、弱势的生长周期内，一些微生物的表观基因组（DNA 上控制基因表达的分子标记）会发生变化，以适应实验条件。之后，它们会生长得更快。

图. 古菌经常在极端的环境中被发现。

上天入地

现在，Epstein 正在开发新技术以进行原位分离和培养新的微生物。

他把这些设备称为 Gullivers，为了纪念 Jonathan Swift 在 1726 年发表的书籍 Gulliver‘s Travel 中的冒险家。

Gullivers 是一些小盒子，其中装满无菌胶体，表面是半渗透膜（就像 ichip 一样），可以让营养素和信号物质扩散进去。这个装置上有一个直径为 1mm 的单向孔，从而只允许一个单独的微生物从环境中进入。这个微生物会堵住入口，但是它的子代将会定殖在盒子中的胶体中并形成菌落。

Epstein 说，最终，他可能不需要打开甚至无需取回 Gulliver 就能够从中得到结果。他畅想，未来，纳米传感器会收集并传回数据，包括氧气或二氧化碳水平、信号物质或抗生素的产生。他开玩笑说，在把这个设备丢到像北冰洋的深度后，研究人员就可以轻松地去度假，而结果会自己不断涌现。

接下来的几个月中，Epstein 计划在埃利伯斯火山（南极的一座活火山）中测试 Gullivers。但是他的最终目标远不止地球，而是把这些设备分散到可能存在生命的地方，比如火星或是木星的卫星木卫二。

时间会告诉我们，这些地方是不是存在微生物。与此同时，地球上丰富的微生物也足够研究人员忙了。Roault 说，有了适当的技术，最终驯化和研究任何微生物都是可能的。

他说：“‘无法培养’是对未来的侮辱。”

参考文献：

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1.Lagier, J.-C. et al. Nature Rev. Microbiol. 16, 540–550 (2018).2.Ngom, I. I. et al. New Microbes New Infect. 33, 100624 (2020).3.Yimagou, E. K. et al. New Microbes New Infect. 32, 100606 (2019).4.Berdy, B., Spoering, A. L., Ling, L. L. & Epstein, S. S. Nature Protoc. 12, 2232–2242 (2017).5.Rheims, H., Rainey, F. A. & Stackebrandt, E. J. Indust. Microbiol. 17, 159–169 (1996).6.He, X. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 244–249 (2015).7.Cross, K. L. et al. Nature Biotechnol. 37, 1314–1321 (2019).8.Gich, F., Janys, M. A., König, M. & Overmann, J. Environ. Microbiol. 14, 2984–2997 (2012).9.Imachi, H. et al. Nature 577, 519–525 (2020).10.Tanaka, T. et al. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7659–7666 (2014).

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原文链接：https://www.nature.com/articles/d41586-020-01684-z

作者｜Amber Dance

编译｜C。

审校｜617

编辑｜笑咲

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